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DNA测序原理

DNA测序技术主要依据 Sanger 的双脱氧链终止法。以DNA单链为模板，在特定条件下，用特异的引物在测序级DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则，不断将 4 种脱氧核糖核苷酸 (dNTP) 加到引物的 3'- 羟基末端并使引物链得到延伸。这种链的延伸是通过引物的 3'- 羟基和脱氧核糖核苷酸底物的 5'- 磷酸基团形成磷酸二酯键来完成的。如果这种反应体系中加入双脱氧核糖核苷酸 (ddNTP) ，这种 2'3'ddNTP 的 5'- 磷酸基团是正常的 (4 种不同的荧光标记 ) ，而 3' 位置缺少羟基，因此在 DNA 聚合酶作用下，仍然可以通过 5'- 磷酸基团与引物链的 3'- 羟基反应掺入到引物链中，但是由于 ddNTP 没有 3'- 羟基，不能继续与下一个 5'- 磷酸基团形成磷酸二酯键而导致引物链延伸的终止。这样，在测序反应体系中， DNA 引物链不断合成与偶然终止，产生一系列的长短不等的核苷酸链，然后将这些反应产物进行电泳，即可得测序图谱。